磺胺甲惡唑檢測試劑盒使用說明書

                                                                 （酶聯(lián)免疫法）

1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液等樣本中的磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的磺胺甲惡唑藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺甲惡唑藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺甲惡唑藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中磺胺甲惡唑的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min

2.3 檢測下限：

組織（高檢測限方法）……………………0.1ppb

組織（低檢測限方法）……………………1ppb

血清、尿液、雞蛋………………………0.4ppb

蜂蜜………………………………………0.1ppb

牛奶………………………………………2ppb

飼料………………………………………4ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

 

2.5 樣本回收率：

組織、蜂蜜、雞蛋………………………………85±25%

尿樣、牛奶、血清、飼料………………………80±25%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96 孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各 1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：1ppm…………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液 A（白蓋）……………………6ml

底物液 B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X 濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2X 復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書………………………………1 份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g）

4.2 微量移液器：單道 20μl-200μl，100μl-1000μl、多道 300μl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、

濃HCl、NaH2PO4·2H2O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液 1：0.1M 磷酸鹽緩沖液

稱取 25.8g Na2HPO4·12H2O 和 4.4g NaH2PO4·2H2O 加去離子水 1000ml 溶解。

配液 2:乙腈-乙酸乙酯溶液

取50ml 乙腈和 50ml 乙酸乙酯加入 100ml 玻璃瓶中，混勻。配液 3：0.5M 鹽酸溶液

4.3ml 濃 HCl 加入去離子水定容至 100ml 混勻。

配液 4：0.2M NaOH 溶液

0.8gNaOH 用去離子水 100ml 溶解配液 5：復(fù)溶液

將2×復(fù)溶液用去離子水 2 倍稀釋(1 份復(fù)溶液加 1 份去離子水)，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在 4℃環(huán)境可保存一個月。配液 5:工作洗滌液

將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織樣本（高檢測限）處理方法

1）稱取 2±0.05g 均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入 1ml 0.1M 磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動樣本成糊狀，加入 7ml 乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 5min；

2）移取 4ml 上層清澈有機(jī)相至干燥容器中，在 50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

3）加入 1ml 正己烷溶解干燥的殘留物，加入樣本復(fù)溶液 1ml。振蕩混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；

4）去除上層正己烷，取 50μl 下層水相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.1ppb 5.3.2 組織樣本（低檢測限）處理方法

1）稱 1.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入 9ml 0.1M 磷酸緩沖液，震蕩 5min，室溫 4000r/min 以上離心 5min；2）取 50μl 上層液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 10 檢測下限：1ppb 5.3.3 雞蛋樣本處理方法

1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；

2）稱取 2.0±0.05g 均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉 1g 加 3ml 去離子水混勻后取 2ml 相當(dāng)于 2g 鮮雞蛋）至 50ml 離心管中，加入 8ml 乙腈，立即用振蕩器振蕩 10min，室溫 4000r/min 以上離

心5min；

3）移取 1ml 上清液至 10ml 潔凈干燥玻璃試管中于，在 50-60℃ 氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

4）加入 1ml 正己烷，用渦旋儀渦動 30s 溶解干燥的殘留物，再加入 1ml 復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動 1min，室溫 4000r/min

以上離心 5min；

5）去上層有機(jī)相，取下層水相 50ul 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 4 檢測下限：0.4ppb 5.3.4 血清樣本處理方法

1）將血樣本于室溫放置 30min，室溫 4000r/min 以上離心10min，分離出血清或過濾血清；

2）取 1ml 血清，加入 3ml 0.1M PB 緩沖液混合，混合 30s；

3）取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4 檢測下限：0.4ppb 5.3.5 蜂蜜樣本處理方法

1）稱取 1±0.05g 蜂蜜樣本于 50ml 離心管中，加入 1ml 0.5M 鹽酸置于 37℃環(huán)境中 30min；

2）加入 2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將 PH 值調(diào)至 5 左右)再加入 4ml 乙酸乙脂振蕩 5min，4000r/min 以上室溫離心 5min；

3）取 2ml 上層液體于 50℃下氮?dú)獯蹈桑?0.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合 30s；

4）取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.1ppb 5.3.6 尿樣本處理方法

1）用 3ml 0.1M PB 緩沖液與 1ml 經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合 30s；

2）取 50μl 液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 4 檢測下限：0.4ppb 5.3.7 牛奶樣本處理方法

1）取 100ul 牛奶樣本用 0.1M PB 緩沖液按 1︰19（v/v）稀釋（即 100ul 牛奶+1.9ml 0.1M PB 緩沖液），混合 30s；2）取 50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20 檢測下限：2ppb 5.3.8 飼料樣本處理方法

1）稱取 2.0±0.05g 飼料樣本至 50ml 聚苯乙烯離心管中，加

入8ml 乙腈，振蕩 5min，室溫 4000r/min 以上離心 5min；

2）移取 1ml 上層有機(jī)相至 10ml 潔凈干燥玻璃試管中，在

50-60℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

3）加入 1ml 正己烷，用渦旋儀渦動 30s，再加入 1ml 0.1M 磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動 30s 混勻，轉(zhuǎn)入 2ml 聚苯乙烯離心管中，室溫 4000r/min 以上離心 5min；

4）除去上層有機(jī)相，移取 100ul 下層水相至 2ml 離心管中，加入 900ul 0.1M 磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動 1min，混勻；5）取 50ul 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：40 檢測下限：4ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

將所需試劑從 4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡 30min 以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。

6.1 編 號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物 50μl/孔，再加入 50μl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃反應(yīng) 45 分鐘。

6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液 250μl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯 色：每孔加入底物液 A 50μl，再加底物液 B 50μl，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終 止：每孔加入終止液 50μl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議用雙波長 450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以 100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 A0—0ppb 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0 標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。 8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。