金霉素檢測試劑盒使用說明書
（酶聯免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋、尿樣等樣本中的金霉素藥物（Chlorotetracycline ，CTC），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的金霉素藥物和酶標板上預包被偶聯抗原競爭抗金霉素藥物抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含金霉素藥物含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中金霉素藥物的殘留量。
2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織、肝臟、雞蛋………………0.6ppb
蜂蜜………………………………4ppb
尿樣………………………………1ppb
2.4 交叉反應率：
金霉素………………………………100%
四環素………………………………29%
土霉素………………………………15%
強力霉素……………………………2.5%
2.5 樣本回收率：
組織（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚）…90±20%蜂蜜……………………………………75±20%
尿樣……………………………………80±20%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96 孔
高濃度標準品溶液 1 瓶：（1ml/瓶）1.0ppm（高標準液有揮發性，需注意密封）
標準品溶液 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb（均為空瓶子，現配現用）。
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液 A（白蓋）……………………6ml
底物液 B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5×復溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）
4.2 微量移液器：單道 20μl-200μl，100μl-1000μl、多道 300μl
4.3 試劑：三氯乙酸、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液 1：1%三氯乙酸溶液
稱取 1g 三氯乙酸加去離子水 100ml 溶解。
配液 2：復溶液
將5×復溶液用去離子水 5 倍稀釋（1 份 5×復溶液加 4 份去離子水），用于樣本的復溶，復溶液在 4℃環境可保存一個月。配液 3:工作洗滌液
將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚）、雞蛋樣本處理方法
1）用均質器均質組織、肝臟、雞蛋樣本；
2）稱取 2±0.05g 樣本于 50ml 離心管中，加入 6ml 1%三氯乙
酸溶液，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上，離心 10min；
3）取出 1ml 上清液于另一試管中，加入 1m 甲醇，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上，離心 10min；
4）取 1ml 上清液在 50-60℃氮氣或空氣吹干，加入 1ml 復溶液溶解殘留的干燥物；
5）取 50 μl 用于分析。
樣本稀釋倍數：6 檢測下限：0.6ppb 5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1）準確稱取 1±0.05g 蜂蜜樣本于離心管中，加入 2ml 1%三氯乙酸，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上，離心 10min；
2）取出 100ul 上清液于另一試管中，加入 1900ul 復溶液稀釋，混合 30s；
3）取 50μl 用于分析。
樣本稀釋倍數：40 檢測下限：4ppb
5.3.3 尿樣本的處理方法
1）用復溶液將尿樣 10 倍稀釋（如果尿樣渾濁一定要過濾或離
心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。
2）取 50μl 稀釋的尿樣用于分析。
樣本稀釋倍數：10 檢測下限：1ppb
6 酶聯免疫試驗步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡 30min 以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
實驗開始前需配制標準品應用液；低濃度的標準品不穩定，需現配現用。
在0ppb 的瓶中加復溶液 3ml，0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、 2.7ppb 的瓶中分別加復溶液 2ml，8.1ppb 的瓶中加復溶液 3ml。
標準液 6：取 1.0ppm 高濃度標準品溶液 24.3ul 加入裝有 3ml 復溶液 8.1ppb 的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為 8.1ppb。
標準液 5：取 1ml 標準液 6 加入裝有 2ml 復溶液 2.7ppb 的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為 2.7ppb。
標準液 4：取 1ml 標準液 5 加入裝有 2ml 復溶液 0.9ppb 的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為 0.9ppb。
標準液 3：取 1ml 標準液 4 加入裝有 2ml 復溶液 0.3ppb 的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為 0.3ppb。
標準液 2：取 1ml 標準液 3 加入裝有 2ml 復溶液 0.1ppb 的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為 0.1ppb。
標準液 1：直接使用復溶液，濃度即為 0ppb。
6.1 編 號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品應用液或樣本 50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液 50μl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，37℃避光反應 30 分鐘。
6.3 洗 滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液 250μl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：加酶標記物 100μl/孔，37℃避光反應 30 分鐘。
6.5 洗 滌：同上
6.6 顯 色：加底物液 A 50μl/孔，再加底物液 B 50μl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，37℃避光顯色 15 分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。
6.7 終 止：加終止液 50μl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于 450nm 處測定每孔吸光度值（建議用雙波長 450/630nm）。測定應在終止反應后 10 分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以 100%，即
| 百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
| A0 |
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 A0—0ppb 標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
8 注意事項
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0 標準的吸光度值小于 0.5 個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見包裝盒。
