Canine Adiponectin ELISA kit用途：
該試劑盒適用于檢測體外血清、血漿或其他相關生物液體，對檢測的樣品進行定性/相對定量的統計分析。
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基本性能：
性 能：
靈敏度：?12.5pg/ml
特異性：?不與其它可溶性結構類似物交叉反應
重復性：?板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15%
檢測范圍：62.5→4000pg/ml
檢測原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心SP-ELISA方法:將特異性的捕獲抗體包被于高親和力的酶標板上，酶標板中對應加入標準品及待測樣品，樣品及標準品中的靶蛋白被捕獲，生物素化的檢測抗體與靶蛋白結合， SP復合物與生物素化檢測抗體結合，形成免疫復合物，檢測過程中每一步經過洗滌液的徹底洗滌，游離的成分均被洗去，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的作用下，若反應孔中有靶蛋白則顯藍色，加入終止液后變黃色，用酶標儀在450 nm處測OD值，靶蛋白濃度與OD值之間呈正比，根據OD值繪制標準曲線計算出樣品中靶蛋白的含量，進而對檢測的樣品進行定性/相對定量的統計分析。
試驗所需自備物品：
1：酶標儀(450nm波長濾光片)
2：高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3：37℃恒溫箱
4：雙蒸水或去離子水
樣品收集方法：
1：血清：全血樣品于室溫放置1小時或2-8℃過夜后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
2：血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于2-8℃，1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。
3：組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1 g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行反復凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
4：細胞提取液：貼壁 細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。
將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
5：細胞培養上清或其他生物體液：收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
樣品注意事項：
1：收集血液的試管應為一次性無內毒素試管。避免使用溶血，高血脂樣品。
2：樣品收集后在1周內進行檢測可保存于2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃(3個月內檢測)，避免反復凍融。在檢測前，冷凍過的樣本應緩慢地融化并離心除去凍融過程產生的沉淀物。室溫混勻后使用。
3：試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關文獻預估樣本中待測物的濃度并通過預實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或者過低，請對樣本做適當的稀釋或者濃縮。
4：若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預實驗驗證其檢測有效性。
5：若使用化學裂解液制備組織勻漿或細胞提取液，由于引入某些化學物質會導致ELISA測值出現偏差。
6：某些重組蛋白可能與試劑盒中捕獲或檢測抗體不匹配而出現不能檢測的情況。
樣本稀釋方案：
請提前預估樣本的濃度范圍，如果您的檢測樣本需要稀釋，參考稀釋方案如下：
稀釋100倍：一步稀釋。取5μL樣本到495μL通用稀釋液內，做100倍稀釋；
稀釋1000倍： 兩步稀釋。取5μL樣本到95μL通用稀釋液內，做20倍稀釋，再取5μL 20倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內，做50倍稀釋，總共稀釋1000倍；
稀釋100000倍：
三步稀釋。取5μL樣本到195μL通用稀釋液內，做40倍稀釋，再取5μL 40倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內，做50倍稀釋，最后取5μL 2000倍稀釋樣本到245μL通用稀釋液內，做50倍稀釋，總共稀釋100000倍；每步稀釋時取液量不少于3 μL，稀釋倍數不超過100倍。每步稀釋都需混合均勻，避免起泡。
Canine Adiponectin ELISA kit檢測前準備工作:
1：提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫(18-25℃)。如果試劑盒需分多次使用，請僅取出本次實驗所需的酶標板條和試劑，剩余板條和試劑需按照指定條件保存。
2：洗滌液配置：用蒸餾水1:20稀釋（例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的蒸餾水）。
3：標準品配制：取7支 EP 管，分別標注S1,S2,S3,S4,S5,S6，blank,每管中加入 500μL 1×標準品及樣品稀釋液,從試劑盒標準品管中吸取 500μL 移至第一管S1中，混勻后吸取500ul移至第二管S2中，如此反復作對倍稀釋，從第六管S6中吸出500ul棄去，第七管為空白對照。標準曲線濃度為: 4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml。
4：生物素化抗體工作液配置:使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×工作液，根據所需用量配置，當日使用，剩余棄之。
5：SP復合物工作液配置:使用前20分鐘，用SP復合物稀釋液將100×SP復合物稀釋成1×工作液，根據所需用量配置，當日使用，剩余棄之。
6：如果您檢測的樣本中靶蛋白濃度高于標準品最高值，建議重新檢測，請根據實際情況，適當倍數稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數)。
操作步驟：
1：加樣：空白孔加入50μl 1×標準品/樣品稀釋液，其余孔各加入標準品或待測樣品50ul，將反應板混勻后置37℃，50分鐘。
2：洗板：用1×洗滌液將反應板充分洗滌3次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向濾紙上印干。
3：空白孔加入100ul生物素化抗體稀釋液，其余孔各加入1×的生物素化抗體工作液100ul，混勻后置37℃，40分鐘。
4：洗板：同上。
5：每孔加入SABC復合物工作液100ul，混勻后置37℃，30分鐘。
6：洗板：用1×洗滌液將反應板充分洗滌5次，每孔加入1×洗液350μl，每次震蕩/浸泡1-2分鐘，向濾紙上印干。
7：每孔加入TMB顯色液90ul，混勻后置37 ℃暗處反應10-25分鐘（具體顯色時間根據顯色結果而定）。
8：每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。每孔加入100ul終止液，混勻，30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。
Canine Adiponectin ELISA kit聲明：
1：限于現有條件及科學技術水平，尚不能對所有原料進行全面的鑒定分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。
2：最終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境等因素密切相關，本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本可能的使用量，預留充足的樣本。
3：為了達到好的實驗結果，請只使用本公司試劑盒內提供的試劑，不要混用其他制造商的產品，嚴格按照說明書操作。
4：由于操作過程中試劑制備以及酶標儀參數設置不正確，可能導致結果異常，實驗前請仔細閱讀說明書并調整好儀器。
5：即使是相同人員操作也可能在兩次獨立實驗中得到不同的結果，為保證結果的重現性，需要控制實驗過程中每一步的操作。
6：試劑盒發貨前會經過嚴格的質檢，然而，因為運輸條件、實驗設備差異等等因素影響，用戶檢測結果可能跟出廠數據不一致。不同批次間試劑盒間的差異也可能來自上述原因。
7：本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的物的產品進行對比，所以不排除檢測結果不一致的情況。
8：試劑盒僅供研究使用，如將其用于臨床診斷或任何其他用途，我公司將不對因此產生的問題負責，亦不承擔任何法律責任。
