己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）是人工合成的非甾體雌激素，能產生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。主要用于雌激素低下癥及激素平衡失調引起的功能性出血、閉經，還可用于死胎引產前，以提高子宮肌層對催產素的敏感性。己烯雌酚不僅是第一種人工合成且可口服的非甾體雌激素（用煤焦油/石油產品就可以合成，同時代的激素基本都是半合成），而且也是最早被發現在懷孕期間服用可以引起子女患癌概率增高的藥物、有“遺傳毒性”的藥物之一
本酶聯免疫檢測試劑盒可以經濟、快速地檢測樣品中的己烯雌酚的含量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中己烯雌酚和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭己烯雌酚抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。隨后結合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的己烯雌酚成負相關。通過標準曲線可準確定量樣品中己烯雌酚的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數即為實際樣品中己烯雌酚的含量。
間接競爭法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變為黃色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、操作人員、移液技術、洗滌技術、培養時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉180度，可以提高測定精度。
顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應按照與顯色劑相同的順序將終止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變為黃色。藍色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
? 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
? 移液器及槍頭；
? 蒸餾水或去離子水
? 100-1000mL刻度量筒。
? 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機。
? 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
? 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品預處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩定性尚未評估。
1. 血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本，將樣本 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
3. 組織勻漿：用 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如1g的組織樣品對應 9mL的PBS）。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
4. 細胞培養物上清：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
5. 其它生物標本：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配制：試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將2000ppb標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至218.7 ppb（例：109μL的標準品母液+891μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的218.7 ppb濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將218.7? ?ppb標準品依次3倍倍比稀釋至7個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：218.7 ppb、72.9 ppb、24.3 ppb、8.1 ppb、2.7 ppb、0.9 ppb、0.3 ppb，從最高濃度標準品溶液中吸取300μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據所需用量配置。
酶標二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據所需用量配置。
備注：如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數 (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據實驗所需酶標板孔數吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結果的穩定性）
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1. 樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標準品/預處理過的待測樣品，同時加入一抗試劑50μL/孔（加一抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟1中的清洗方式清洗4次。
3. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4. 終止反應：待顯色反應結束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1. 加標準品/樣品和一抗，37℃反應30分鐘，洗滌3次。
2. 加酶標二抗，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3. 加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4. 加終止液，在5分鐘內讀數。
結果的計算
以濃度的對數為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出四參數邏輯函數的標準曲線?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮颠壿嫞?-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
精密度
批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。
批內變異系數 CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。
批間變異系數 CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.3 ppb。
線性關系
校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.9980。
交叉反應性
己烯雌酚：100%
注意事項
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
本試劑盒由上海酶聯生物提供，有關實驗標準曲線和數據請下載本產品說明書
