簡介
氯霉素(malachitegreen,MG)是一種可高效殺菌、殺寄生蟲且成本低廉的藥物，在世界各國水產(chǎn)品養(yǎng)殖領(lǐng)域中被廣泛使用。但是MG在環(huán)境和生物體內(nèi)殘留量高、殘留時間較長，不僅會極大的污染生態(tài)環(huán)境，還會對人體造成致癌、致畸等不良影響。
本酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可以經(jīng)濟、快速地檢測水產(chǎn)組織樣品中氯霉素的殘留量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中氯霉素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭氯霉素抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的氯霉素成負相關(guān)。通過標準曲線可準確定量樣品中氯霉素的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實際樣品中氯霉素的含量。
間接競爭法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設(shè)計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。藍色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋、移液槍
試劑：乙酸乙酯、正己烷、蒸餾水、試劑A：0.36M亞硝酸基鐵氰化鉀（*水溶液易分解由紅色變成綠色此時不能再用）（牛奶，奶粉用）、試劑B：1M硫酸鋅（牛奶，奶粉用）
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
1.魚蝦和肉樣樣本
（1）稱取均質(zhì)后的組織樣本3±0.05g于15mL離心管中；
（2）加入3mL的蒸餾水，振蕩混勻；
（3）加入6mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）。
（4）移取上層溶液4mL于15ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干。
（5） 吹干后加入1mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則重復(fù)離心）
（6）取50μL下層用于分析。
樣品稀釋倍數(shù)：0.5倍
2.蜂蜜樣本
（1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g于15mL離心管中；
（2）加入4mL的蒸餾水，充分振蕩混勻；
（3）加入4mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）。
（4）移取上層溶液2mL于15ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干。
（5）吹干后加入1mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則重復(fù)離心）
（6）取50μL下層用于分析。
樣品稀釋倍數(shù)：1倍
3.牛奶樣品
（1）取10mL牛奶樣品，加入50mL離心管；
（2）加入10mL正己烷，充分振蕩5min，4000r/min，離心10min；
（3）從底部取5mL無脂牛奶于15mL離心管中；
（4）加入500μL試劑A，振蕩1min；加入500μL試劑B，劇烈震蕩5min；4℃ 4000r/min離心10min；
（5）取1.8mL上清至15mL離心管中，加入6mL乙酸乙酯，劇烈震蕩5min；4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）
（6）取上層乙酸乙酯4mL到離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干；
（7）吹干后加入1mL正己烷，再加入200μL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；
（8）去除上層正己烷相，取下層水相50μL用于檢測。
樣本稀釋倍數(shù)：1倍
4.蛋
（1）取1g已勻漿全蛋（含蛋白和蛋黃）于15mL離心管中；
（2）加入6mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）
（3）取上層乙酸乙酯3mL到15mL離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干；
（4）吹干后加入1mL正己烷，再加入200μL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；
（5）去除上層正己烷相，取下層水相50μL用于檢測。
樣本稀釋倍數(shù)：1倍
5.飼料
（1）取1g飼料于15mL離心管中；
（2）加入4mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復(fù)離心）
（3）取上層乙酸乙酯1mL到15mL離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干；
（4）吹干后加入1mL正己烷，再加入200μL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；
（5）去除上層正己烷相，取下層水相50μL用于檢測。
樣本稀釋倍數(shù)：4倍
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配制：試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將1000ppb標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至50ppb（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的50ppb濃度標準品），隨后在7個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這7個單獨的試管中將50ppb標準品依次2倍倍比稀釋至7個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：50ppb、25ppb、12.5ppb、6.25ppb、3.13ppb、1.56ppb，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ppb)。
一抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標二抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預(yù)實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲存，且避免反復(fù)凍融。
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復(fù)孔檢測
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標準品/預(yù)處理過的待測樣品，同時加入一抗試劑50μL/孔（加一抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1.加標準品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計算
以濃度的對數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為1.56 ppb。
線性關(guān)系
校準品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù) r 值，大于等于 0.999。
交叉反應(yīng)性
氯霉素：100%
注意事項
1.此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹慎操作。
2.該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3.顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4.佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
