簡介
克拉霉素屬14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。其機(jī)制是通過阻礙細(xì)胞核蛋白50S亞基的聯(lián)結(jié)，抑制蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生抑菌作用。克拉霉素抗菌譜與紅霉素、羅紅霉素等相同，但對革蘭陽性菌如鏈球菌屬、肺炎球菌、葡萄球菌的抗菌作用略優(yōu)，且對誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅霉素耐藥菌株亦具一定抗菌活性。克拉霉素及其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物對流感桿菌的抗菌作用增強(qiáng)，對淋球菌、李斯忒菌、空腸彎曲菌也有一定作用，而對嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、沙眼衣原體、溶脲脲原體等的作用比紅霉素為強(qiáng)。主要用于敏感細(xì)菌所致的上、下呼吸道，包括扁桃體炎、咽喉炎、鼻竇炎、支氣管炎、肺炎等、皮膚、軟組織感染、膿癤、丹毒、毛囊炎、傷口感染等，療效與其他大環(huán)內(nèi)酯類相仿。該品也可用于沙眼衣原體或溶脲脲原體所致生殖泌尿系感染、艾滋病患者的非典型分支桿菌感染等。
本酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可以經(jīng)濟(jì)、快速地檢測樣本中克拉霉素特異性的含量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中克拉霉素特異性和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭克拉霉素特異性抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的克拉霉素特異性成負(fù)相關(guān)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量樣品中克拉霉素特異性的含量。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實際樣品中克拉霉素特異性的含量。
間接競爭法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設(shè)計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。當(dāng)使用自動洗板機(jī)時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
?酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
?移液器及槍頭；
?蒸餾水或去離子水
?100-1000mL刻度量筒。
?洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機(jī)。
?水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
?用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
1.水樣
⑴ 取2 mL水樣，用酸或者堿調(diào)pH到6~7；
⑵ 取1.0 mL上述調(diào)好的水樣加入4 mL 35% 甲醇/65% 1X PBS；渦旋 10 分鐘；
⑶ 4,000 x g在室溫 (20–25°C (68–77°F)離心5分鐘，取上清。過濾取清液也可以；
⑷ 每孔取50μL上清進(jìn)行檢測。
稀釋倍數(shù)：5
2.肉組織
除去脂肪，勻質(zhì)樣品
⑴稱取1g的樣品，加入4mL 35%乙醇/65%1×PBS溶液, 最大轉(zhuǎn)速漩渦振蕩3min。
⑵ 室溫（22.5±2.5）°C 4000 rpm離心10分鐘；取上清750μL于干凈管中，加入750μL 正己烷，渦流1分鐘。室溫下4000xg 離心4分鐘。
⑶ 除去上層正己烷，每孔取50 μL下清液進(jìn)行測試。
稀釋倍數(shù)：5
3. 血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先將10000 ppb標(biāo)準(zhǔn)品（100μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至270 ppb（例：27μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+973μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的270 ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在5個試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這5個單獨的試管中將270 ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次3倍倍比稀釋至6個梯度，共配制6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：270 ppb、90 ppb、30 ppb、10 ppb、3.33 ppb、1.11 ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取300μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預(yù)實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲存，且避免反復(fù)凍融。（若實驗在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性）
實驗步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過的待測樣品，同時加入一抗試劑50μL/孔（加一抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1.加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計算
以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為1.11 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù) r 值，大于等于0.9980。
交叉反應(yīng)性
克拉霉素特異性：100%
注意事項
1.此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
2.該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3.顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4.佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
