簡介
氨苯砜( dapsone，DDS) 為砜類抑菌劑，對麻風桿菌有較強的抑菌作用，大劑量時顯示殺菌作用。DDS和磺胺類藥物在分子結構上的相似，其作用機制與磺胺類藥物相似，通過競爭性結合二氫葉酸合成酶、抑制二氫葉酸的合成發(fā)揮抑菌作用。氨苯砜與其他抑制麻風藥聯(lián)合用于由麻風分枝桿菌引起的各種類型麻風和皰疹樣皮炎的治療，也用于膿皰性皮膚病、類天皰瘡、壞死性膿皮病、復發(fā)性多軟骨炎、環(huán)形肉芽腫、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的某些皮膚病變、放線菌性足分支菌病、聚會性痤瘡、銀屑病、帶狀皰疹的治療。
本酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可以經濟、快速地檢測血清、組織等樣本中的DDS的殘留量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中DDS和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭DDS抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。隨后結合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的DDS成負相關。通過標準曲線可準確定量樣品中DDS的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實際樣品中DDS的含量。
間接競爭法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、操作人員、移液技術、洗滌技術、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉180度，可以提高測定精度。
顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應按照與顯色劑相同的順序將終止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。藍色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
?酶標儀，450nm/630nm
?移液器及槍頭；
?蒸餾水或去離子水
?100-1000 mL刻度量筒。
?洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機。
?恒溫培養(yǎng)箱，振蕩器，天平（感量0.01g）
?用于稀釋標準品和樣品的試管。
?50mL離心管
樣品預處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
1.細胞培養(yǎng)上清液：以1000×g離心20分鐘，去除顆粒，立即進行測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環(huán)。（由于基質效應，細胞培養(yǎng)上清液樣品建議10倍稀釋。例如：20μL樣品+180μL的1×稀釋液）
2.血清：使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進行測定或等分裝樣品，將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環(huán)。（由于基質效應，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
3.血漿：使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內，以1000×g離心15分鐘。立即測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環(huán)。（由于基質效應，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
注：檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經驗證可用于本試驗，使用時應自行驗證可行性。溶血的樣品不適合用于該測定。
4.組織勻漿：用預冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響檢測結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
5.細胞裂解液：貼壁細胞用預冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用預冷PBS清洗3次，每1×106個細胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當減少PBS體積）并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
6.其它樣本類型：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配制：試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將3000ppb標準品（300μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至729 ppb（例：243μL的標準品母液+757μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的729 ppb濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將729 ppb標準品依次3倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：729 ppb、243ppb、81ppb、27ppb、9ppb、3ppb、1ppb，從最高濃度標準品溶液中吸取300μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結果的穩(wěn)定性）
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標準品/預處理過的待測樣品，同時加入抗試劑50μL/孔（加抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟1中的清洗步驟3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟1中的清洗步驟4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4.終止反應：待顯色反應結束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1.加標準品/樣品和一抗，37℃反應30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標二抗，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內讀數(shù)。
結果的計算
以濃度的對數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。
批內變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為1 ppb。
線性關系
校準品劑量反應曲線相關系數(shù) r 值，大于等于0.9990。
交叉反應性
氨苯砜：100%
注意事項
1.此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。
2.該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
3.顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
4.佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
