簡(jiǎn)介
偶氮玉紅（Azorubine），又名酸性紅，為人工合成色素，通過(guò)重氮化4-氨基萘磺酸和4-羥基萘磺酸之間的偶合反應(yīng)合成，大量食用合成色素后，對(duì)人身體健康會(huì)造成潛在危害。食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)《GB2760-2014》規(guī)定偶氮玉紅可用于冷凍飲品，如可可制品、巧克力和巧克力制品（包括代可可脂巧克力及制品）以及糖果，還有焙烤食品餡料及表面用掛漿（僅限餅干夾心），然而某 些不法分子為增加產(chǎn)品色澤，在食品中超范圍或非法添加偶氮玉紅，對(duì)人們的健康造成危害。目前國(guó)家尚未發(fā)布食品中偶氮玉紅的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)對(duì)食品中偶氮玉紅的檢測(cè)也鮮有報(bào)道。敏感人群和哮喘病患者會(huì)對(duì)它出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。代表性產(chǎn)品是糖果、蛋白杏仁糖、果凍。瑞典、美國(guó)、奧地利和挪威禁止其用于食品加工。
本酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒可以經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)血清、組織及辣椒粉等樣品中偶氮玉紅的殘留量。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中偶氮玉紅和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)偶氮玉紅抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的偶氮玉紅成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中偶氮玉紅的含量。
間接競(jìng)爭(zhēng)法模式圖
按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無(wú)色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測(cè)定。
檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過(guò)試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來(lái)源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)
為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。
當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。
顯色劑應(yīng)保持無(wú)色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
?酶標(biāo)儀，450nm/630nm
?移液器及槍頭；
?蒸餾水或去離子水
?100-1000 mL刻度量筒。
?洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)。
?恒溫培養(yǎng)箱
?振蕩器
?天平（感量0.01g）
?用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
?50mL離心管
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。
1.食品樣品（如豆腐皮、辣椒面）：
⑴稱取試料5.0 g于50 ml離心管中，加入25 mL甲醇。漩渦混勻，超聲提取30分鐘。
⑵離心分離（11000 r/min, 10 min），取上清液于梨形瓶中，殘?jiān)屑尤爰状?5 mL。
⑶合并兩次的上清液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度。
⑷樣液進(jìn)行離心分離（11000 r/min, 10 min）。上清液以0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析
2.血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
3.血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本，將樣本 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
4.組織勻漿：用 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng) 9mL的PBS）。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
5.尿液樣本：采集樣品，4℃下以10000 xg離心2分鐘。分裝上清液，并將樣品儲(chǔ)存在-80℃下。盡量減少凍融循環(huán)。
6. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)。
7. 其它生物標(biāo)本：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測(cè)
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將3000ppb標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至146 ppb（例：49μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+951μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的146 ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中146 ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次3倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：146 ppb、48.6 ppb、16.2ppb、5.4ppb、1.8ppb、0.6ppb、0.2ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取300μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：如樣本中待測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長(zhǎng)時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品，同時(shí)加入抗試劑50μL/孔（加抗試劑時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗步驟3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗步驟4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器，根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）
4.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
實(shí)驗(yàn)步驟匯總
1.加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計(jì)算
以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.2 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.998。
交叉反應(yīng)性
偶氮玉紅：100%
注意事項(xiàng)
1.此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
2.該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3.顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4.佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
